16S测序

1.产品简介

16SrDNA是原核生物编码16SrRNA的基因，长度约为1500bp，由10个保守区和9个可变区（V1-V9）组成，可变区反映了物种间的差异性。16SrDNA-seq是通过提取微生物菌群的DNA，选择可变区的特定区段(V3-V4)进行PCR扩增，再通过高通量测序的方法，帮助研究人员分析特定环境中微生物群体基因组成及功能、微生物群体的多样性与丰度，进而分析微生物与环境、微生物与宿主之间的关系，发现具有特定功能的基因。在医学领域，主要应用于肠道微生物与疾病的关联分析，揭示疾病与健康个体间微生物的差异，研究药物或饮食干扰后菌群差异，或某一病程发展过程中肠道菌群的变化，如结直肠癌等。

2.技术路线

宏基因组DNA提取：根据不同的样品类型采用不同的提取方案，获得高质量的宏基因组DNA。

DNA质量检测：Nanodrop检测DNA样品浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品完整性。

16s可变区PCR扩增：引物设计扩增可变区的特定区段（V3-V4区）。

第二次PCR扩增：在DNA分子两端引入接头序列及index序列。

文库质检：Agilent2100 Bioanalyzer检测文库大小分布，Qubit3.0或荧光定量PCR测定文库浓度。

上机测序：根据数据量要求将文库pooling上机测序。

数据分析：下机数据由专业生物信息分析团队进行数据分析，提供全面数据分析报告。

3.样品要求

样品类型：Meta样品，如粪便、土壤、水样等或Meta DNA样品。

样品量：Meta样品请提供3g以上，DNA样品3 μg以上。

样品质量：DNA无明显降解，无蛋白污染，OD260/280值≥1.5，OD260/230值≥1.0，浓度≥30 ng/μL。

样品保存：DNA样品：可将DNA溶于NucleaseFree 超纯水中，-20℃保存。样品保存期间避免反复冻融。

样品运输：样品置于1.5 mL管中，封口膜封好，冷冻运输。

4.测序方案

测序模式 MiseqPE300

测序数据量 0.05Mclean reads

5.生物信息分析内容

（1）基础分析  

原始数据处理及统计；

可变区域验证；

操作分类单元（OTU）聚类及分析；

单样本物种分类及丰度分析；

多样品物种丰度分析；

Alpha多样性分析

Beta多样性分析

（2）高级分析

样品差异主要因子分析；

组间显著性差异分析；

系统进化树构建；

个性化分析

转录组测序

1.产品简介

       转录组测序，对某一物种或特定细胞在某一功能状态下产生的mRNA进行高通量的二代测序，既能够定量分析，检测基因表达水平的差异，又能够提供结构分析，可以发现稀有的转录本，精确地识别可变剪切位点、基因融合等，而且不需要依赖于参考基因组。数字化信号，直接测定几乎所有转录本片段的序列，可以检测基因家族中相似基因及可变剪接造成的单碱基差异。

2.   技术路线

3.送样要求

新鲜培养细胞 (细胞数)：≥2×105cell；

新鲜动物组织干重：≥30mg；

新鲜植物组织干重：≥100mg；

全血：≥1 mL 全血收集的淋巴细胞；

菌体（细胞数或干重）：≥2×105cell 或 ≥30mg；

FFPE：≥5片，未染色，100mm2，5~10μm 厚度；

4.常见问题

（1）下机数据格式是什么？

通用下机数据格式：（FASTQ）让数据兼容性更好。

（2）真核转录组推荐数据量？

推荐6G或者10G数据量。

蛋白质组学

1.产品简介

定量蛋白质组学（Quantitative Proteomics）是对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系内所有蛋白质进行精确鉴定和定量。可用于筛选和寻找任何因素引起的样本之间的差异表达蛋白，结合生物信息学揭示细胞生理病理功能，同时也可对某些关键蛋白进行定性和定量分析。

      iTRAQ（Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation）技术是美国应用生物系统AB公司研发的一种体外同重同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白组表达量差异，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。

TMT（Tandem Mass Tag）串联质谱标记技术是由Thermo公司研发的一种体外同重同位素标记的相对与绝对定量技术。广泛用于差异表达蛋白质分析研究中。蛋白定量TMT技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，包括4plex、8plex、16plex等不同数量标签的产品，经高精度质谱仪串联分析，最新推出的TMTpro 18plex可同时比较多达18个样品之间的蛋白组表达量差异，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。

  DIA蛋白定量分析，主要采用数据非依赖性采集模式（data independentacquisition，DIA），通过液质联用技术（LC-MS/MS）对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，结合传统的数据依赖性采集模式（data dependent acquisition，DDA）构建的谱图库，可对蛋白质组进行鉴定、定量，获得肽段、蛋白及所属物种来源、蛋白表达量变化等信息。DIA具有高通量、高分辨率、高可重现性、定量准确等优点，而且样本无需分级上机，极大的缩短了每个样品的检测时间，适合大样本量的蛋白质组研究。

2.    送样要求

（1）组织类样品

新鲜动物组织：干重≥10mg；

植物和蕈类真菌类样品湿重：富含杂质或蛋白质含量低的样品量干重≥5g，如植物的根、木质部、韧皮部组织等；蕈类真菌类样品湿重≥300mg；

新鲜培养细胞数：≥1×107（细胞沉淀体积约30μl~50μl左右）；

血液类：血清、血浆≥200µl，解冻后血细胞会破裂，蛋白溶出来会影响分析，因此一般不建议送全血。

（2）蛋白类样品

蛋白液：≥100μg，浓度≥0.5µg/µL。

3.    应用

人类疾病研究：疾病生物标志物筛选和验证、疾病发生发展过程中的蛋白表达调控机制、药效评估

动植物基础研究：重要农作物农艺性及其改良措施、动植物生长发育机制研究、抗逆抗病机制研究

致病机理研究、耐药性研究、宿主-微生物的相互作用机制研究。

4.    常见问题

（1）iTRAQ等标记定量怎样设置重复？

推荐至少进行3次或以上生物学重复。

（2）为什么有些差异表达基因在蛋白层面没有相应的差异蛋白？

从生物学角度看，由于RNA调控、蛋白降解、蛋白分泌、转录和翻译效率不一致等原因，导致蛋白水平和转录水平未必呈现一样的趋势，这是正常现象。

（3）不同试验的样本做iTRAQ等标记定量可否放在一组上机？

不能。因为不同试验的研究对象一般有差异，即便是同样的物种，处理方式也会有不同，不同样本混在一起上机，会提高样本中蛋白种类的复杂程度，影响质谱的分辨能力，降低蛋白鉴定数目和定量效果。所以不同来源的样本，蛋白表达差异过大者，必须分别上机进行检测。

（4）细胞分选时候遇到死细胞，会否对后续实验有影响吗？

需要在分选前可以先过滤掉死细胞。分选过程造成细胞死亡无法剔除，分选后尽快将细胞冻存在-20℃，避免细胞破裂。

代谢组学

非靶向代谢组学：基于液质联用技术（LC-MS），无偏向性、尽可能多地检测细胞、组织、器官或体液等生物样本内所有的小分子代谢物，对实验组和对照组进行对比分析，通过统计分析筛选差异代谢物，对差异代谢物进行代谢通路分析，进而寻找代谢物与生理病理变化的相对关系。

靶向代谢组学：主要是以标准品为参照，对特定的某一代谢物或某一类代谢物进行有针对性的检测和定量；通过标准曲线计算代谢物浓度，从而实现绝对定量。靶向代谢组具有特异性强，检测灵敏度高和定量准确等特点，一方面，靶向代谢组作为全代谢组的延伸，可为后续代谢分子标志物的深入研究和开发利用提供有力支持另一方面，通过对某类代谢物准确定量分析也可以结合其它实验数据揭示相关的分子生物学作用机制。

2.    送样要求

细胞≥10⁷ 个

血清、血浆≥250 µL

动物及临床组织≥200 mg

粪便、肠道内容物≥200 mg

植物样本≥200 mg

微生物≥ 10⁷个或≥100 mg

3.应用

疾病诊断、发病机理及预后研究

机体发育调控研究

药物作用机制及靶点研究

天然药物研究与新药筛选

微生物感染及发病机理研究

肠道菌群与疾病研究

4.常见问题

（1）代谢组研究相对于基因组和蛋白质组研究而言有什么不同？

代谢组学的技术不需建立全基因组测序及大量表达序列数据库；基因和蛋白表达的有效的微小变化会在代谢物上得到放大，从而使检测更容易；因为代谢产物在各个生物体系中都是类似的，所以代谢组学研究中采用的技术更通用。

（2）标准曲线如何制作？

选取不同浓度的标准品溶液（5-8个浓度点），根据标准品浓度和标准品信号响应峰面积拟合线性方程，得到标准曲线。

宏病毒组

1.产品简介

     病毒宏基因组测序又称宏病毒组（Virome），是在宏基因组学理论的基础上，结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科分支。宏病毒组直接以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，能够快速准确的鉴定环境中所有的病毒组成，是一种发现新病毒、病毒感染预警和控制的有力手段，在病毒的起源和进化模式、遗传多样性和地理分布等研究方面也具有重要意义。

2.   技术路线

3.送样要求

（1）清澈水体或海水: 20L以上超滤浓缩或者FeCL3沉淀之后送样;

（2）土壤、淤泥、沉积物>3g;

（3）粪便或肠道内容物23g;

（4）组织样本22g;

（5）血液样本>10mL (建议送血清) ；

样品全程使用干冰运输，避免反复冻融

4.常见问题

（1）上机测试策略是什么？

通用的上机测试策略是PE150

（2）测序数据量是多少？

推荐10G数据量

（3）周期是多久？

60个工作日

动植物基因组De novo测序

1.产品简介

动植物基因组De novo测序分析也叫从头测序分析，指不依赖于任何参考序列信息就可对某动植物进行测序分析，使用最新的生物信息学方法进行序列拼接获得某物种的基因组序列图谱，并进行基因组结构注释、功能注释、比较基因组学分析等一系列的后续分析。三代测序技术（以PacBio和Nanopore为代表）具有读长长的特点。该类型测序分析结果可以广泛应用于农林鱼牧医药及海洋等各个方面的研究。

2.   技术路线

应用于种群遗传多态性分析、进化分析、挖掘功能基因、指导育种等众多研究领域。

3.送样要求

（1）样品需求量

植物组织：嫩叶鲜重2g；

高等或大型动物：肌肉组织鲜重2g；

微体型动物：动物体累计鲜重2g；

昆虫：正常体型3g，微体型2g；

血液（抗凝）：正常体型3g，微体型2g

（2）DNA总量HiFi≥6.5 μg，浓度：≥80 ng/L；

（3）样品纯度：OD260/280=1.8-2.0，OD260/230=1.6-2.5并确保DNA无降解，无污染。

（4）样品保存期间切忌反复冻融，送样时请使用干冰运输。

5.常见问题

（1）怎么查询基因组的大小？

查询植物基因组大小的网站：http://data.kew.org/cvalues/CvalServlet?querytype=2；

查询动物基因组大小的网站：http://www.genomesize.com/search.php。

换算关系：1pg=978Mb。

动植物基因组重测序测序

1.技术简介

动植物基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。它可以获取最全的基因组信息，找到大量的单核苷酸多态性位点（SNP），插入缺失位点（InDel，Insertion/Deletion）、杂合性缺失（LOH）、拷贝数变异（CNV）以及基因组重排导致的结构变异位点（SV，Structure Variation）。通过生物信息手段，分析不同个体基因组间的结构差异，同时完成注释。

2.技术路线

3.数据分析流程：

（1）获得原始测序序列

（2）序列对比

（3）进行覆盖度计算、SNP、Indel，结构变异检测

（4）SNP、Indel，结构变异检测生物信息学注释

4.送样要求

（1）样品需求量

植物组织：嫩叶鲜重2g；

高等或大型动物：肌肉组织鲜重2g；

微体型动物：动物体累计鲜重2g；

昆虫：正常体型3g，微体型2g；

血液（抗凝）：正常体型3g，微体型2g

（2）DNA总量≥6.5 μg，浓度：≥80 ng/μL；

（3）样品纯度：OD260/280=1.8-2.0，OD260/230=1.6-2.5并确保DNA无降解，主峰＞20Kb，无蛋白，RNA/盐离子等污染，样本无色透明不粘稠 。

（4）样品保存期间切忌反复冻融，送样时请使用干冰运输。

5.应用

种群遗传多态性分析、进化分析、挖掘功能基因、指导育种等众多研究领域。

6.常见问题

（1）进行全基因组重测序数据推荐？

每个样本推荐的数据量与样本类型和要做的信息分析内容相关。关注个体样本的SNP，对SNP的准确度和覆盖度要求比较高，一般推荐测序深度>30X，对于稀有变异测序深度还要进一步提高；研究群体结构的样本，测序深度推荐>10X；纯合样本混样检测等位基因频率，推荐平均每个样本的测序深度>1X，混合样本测序深度不低于30X；DH和RIL群体构建Bin Map，子代群体测序深度可以测序1X/样本。

（2）重测序reads与参考基因组比对率低，可能的原因是什么？

参考基因组序列组装质量较差，引起比对率低；比对参数设置严格；测序样本与参考基因组亲缘关系比较远，同一个物种野生种与驯化种差异还是很大的；可能因为DNA不纯，存在其他物种的污染等。

细菌de novo

1.产品简介

细菌基因组denovo测序，即从头测序，是指在没有任何现有的序列信息的情况下，对某个细菌物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼装，从而获得该细菌物种的基因组序列。随着高通量测序技术和生物信息学的快速发展，细菌全基因组denovo测序已成为一种探究细菌生物学问题的高性价比方法。通过全基因组测序，可以获知待测菌株的基因及相关调控信息，为研究该菌株特有的生物学特征提供分子基础；通过比较基因组分析，可以研究种内及种间的相互进化关系，为探究疾病的传播机制提供理论指导。

目前，细菌基因组测序已经广泛应用于细菌流行病学、疫苗开发、微生物进化等多个领域。此外，细菌全基因组denovo测序也能为该物种后续基因组数据的挖掘以及重要基因的功能分析构建一个全面的研究平台。

2.技术路线

3.送样要求

（1）样品类型： DNA/菌体

（2）样品需求量（单次）：菌体样本：≥5g； 基因组DNA：≥2μg（框架图），基因组DNA：≥10μg（完成图）

（3）样品浓度：≥20ng/µL

（4）样品纯度：OD260/280=1.8-2.0并确保DNA无降解，无污染。

（5）样品保存期间切忌反复冻融，送样时请使用干冰运输。

4.应用

基因功能研究：预测重要基因和蛋白研究功能与机制、寻找关键功能基因。

进化分析：研究细菌种内进化关系、研究细菌进化遗传机制。

病原菌：鉴定病原菌致病机制、研究致病细菌致病机制、开发研究抗生素、疫苗、药物。

5.常见问题

（1）对于细菌基因组测序，三代和二代测序相比有何优势？

三代测序相比二代测序而言，其优势在于读长长，GC含量影响小，而劣势是测序成本偏高。对于细菌基因组测序来说，三代测序的长读长可以解决细菌中的重复序列问题，也避免了异常GC菌株的测序不均匀问题。由于细菌基因组较小，需要的测序量不大，对于较为精细的细菌完成图来说，三代成本甚至低于二代结合一代的策略。目前为止，在需要组装完整性较低的细菌框架图层面，二代测序仍能保持一定成本优势。随着三代测序通量提升和成本降低，未来三代测序有望在细菌基因组领域获得更广泛的应用。

（2）细菌基因组中如何预测核糖体rDNA基因？

预测细菌基因组中的核糖体rDNA基因，通常有两种方法：一是通过rDNA序列结构特征进行de novo 预测，二是利用近缘rDNA序列进行同源预测。其中前者预测更准确，但是需要组装结果中具备完整的rDNA结构。在框架图结果中，可能有rDNA区域组装不完整，分布于多条scaffold中的情况，会导致de novo 方法rDNA预测不到的情况。如果想要获得更完整的预测结果，可以预先提供近缘rDNA序列，使用同源预测方法，以改善预测效果。

（3）群体进化分析，对于参考基因组选择有什么要求？

为研究多个菌株之间的进化顺序和起源关系，可以选择这些菌株之间的单拷贝核心基因作为遗传标记，构建进化树，并以此为基础进行地域传播、分歧时间、选择压力等相关研究。一般来说，选择的基因组间亲缘关系越远，单拷贝核心基因的数目也就越少。如果单拷贝核心基因的数目低于一定限度，如数百个基因以下，则进化树的精度会受到影响。以典型的应用场合为例，可以选择5株左右同一属的菌株，再额外选择2株左右临近属的菌株作为外群，总共5~8株菌株用于构建进化树。

细菌重测序

1.产品简介

细菌基因组重测序是指对基因组序列已知的细菌个体进行基因组测序，通

过与已知的参考基因组比对，获得该细菌个体或群体的差异的测序方法。这些

差异主要包括：SNP（单核苷酸多态性位点，Single Nucleotide

Polymorphism、InDel（插入缺失位点, lnsertion & Deletion）、SV（结构

变异位点，Structural Variation）。将单个参考基因组信息扩增为生物群体的遗传特征。通过双末端（Paired-End）测序，检测基因序列间的位点差异和结构变异，在全基因组水平上解释导致性状差异的原因。

2.技术路线

3.技术优势

（1）与SNP芯片技术相比，基因组重测序能够发现未知的遗传变异信息。

（2）与传统测序技术相比，基因组重测序数据通量更高、速度更快、成本更低。

（3）基因组重测序可以检测SNP、InDel、SV等多种遗传变异类型。

4.送样要求

（1）样品类型： DNA/菌体

（2）样品需求量（单次）：菌体样本：≥5g； 基因组DNA：≥3μg，DNA电泳条带单一，无明显降解。

（3）菌体送样：收集生长对数期菌体，收集离心菌体数3×10的9次方个，与无菌离心管中，液氮速冻干冰运输。

（4）样品保存期间需-80℃冰箱保存，切忌反复冻融，干冰运输。

5.应用

（1）病原微生物的检测及鉴定、病原菌演变及起源、致病菌种群结构及种群结构的进化等众多方面；

（2）食用/药用真菌功能基因挖掘；

（3）群体进化研究。

真菌denovo测序

1.产品简介

真菌denovo测序，又叫真菌基因组从头测序，指不依赖于任何参考序列信息就可对某个真菌进行分析的测序分析技术，用生物信息学的方法进行序列拼接，可以预测真菌基因组中所包含的基因，从而获得该物种的基因组序列图谱，并进行功能注释等一系列的数据分析。

真菌基因组de novo测序，是一种在无参考基因组的情况下，对微生物基因组序列进行从头组装，并结合数据库对基因组进行注释，以此为基础开展相关下游分析的产品。

2.技术路线

3.送样要求

（1）样品类型： DNA

（2）样品需求量（单次）：基因组DNA：≥1μg

（3）样品浓度：≥12.5ng/µL

（4）样品纯度：OD260/280=1.8-2.0并确保DNA无降解，无无蛋白，RNA/盐离子污染。

（5）样品保存期间切忌反复冻融，送样时请使用冰袋或干冰运输。

4.应用

（1）预测真菌的重要基因和蛋白以了解其功能和可能机制；

（2）可以鉴定致病真菌与农作物互作及致病的相关基因，并可用于研究与其近缘物种的进化关系，比较基因组研究等；

（3）食品、能源等工业领域工程菌构建；

（4）另外还可用于生物防治真菌的研究，工业酵母菌的研究；

（5）辅助多组学分析。

真菌重测序

1.产品简介

基因组重测序是对已知的基因组进行测序，并对个体或者群体样品进行分析。真菌重测序可以辅助研究者发现真菌单核苷酸多态性位点（SNPs）、插入（Insertion）、缺失（Deletion）等变异类型，将单个参考基因组信息扩增为生物群体的遗传特征。通过双末端（Paired-End）测序，检测基因序列间的位点差异和结构变异，在全基因组水平上解释导致性状差异的原因。

2.技术路线

3.送样要求

（1）样品类型： DNA

（2）样品需求量（单次）：基因组DNA：≥1μg

（3）样品浓度：≥12.5ng/µL

（4）样品纯度：OD260/280=1.8-2.0并确保DNA无降解，无无蛋白，RNA/盐离子污染。

（5）样品保存期间切忌反复冻融，送样时请使用冰袋或干冰运输。

4.应用

（1）病原真菌致病因子分析

（2）食用/药用真菌功能基因挖掘

（3）群体进化研究

5.常见问题

（1）真菌的DNA样品怎么准备？

选取无性生殖阶段、营养体的菌丝，避免在生成高等复杂结构的时期提取样品。如果实验条件允许，最好挑取单个孢子培养萌发大量菌丝，然后利用这些由同一孢子萌发的菌丝进行样品制备。

（2）对于一些不能单独培养的真菌，该怎么做？

如果寄主的物种序列已知，可以将属于寄主的序列过滤掉，再进行组装；但寄主的物种序列是未知，这种情况就比较难做到。